Российские учёные получили противоядие от пестицидов

16-10-2013

Российские учёные получили противоядие от пестицидов
Антидот к фосфорорганическим токсинам, способный поменять известное противоядие атропин, разработали в лаборатории биокатализа ИБХ РАН. В базе технологии — получение рекомбинантных белков в клеточках млекопитающего.

По продуктивности и цены разработка ИБХ выигрывает у других разработок, что позволяет гласить о способности промышленного выпуска антидота.
В 1936 году германский химик Герхард Шрадер, занимавшийся разработкой инсектицидов на базе фосфорорганических токсинов, синтезировал новое вещество, которое уничтожало насекомых, поражая их нервную систему.

Оно получило заглавие «табун». Случаем пролив каплю этого вещества, учёный нашел, что табун отравляет и людей.

Подчиняясь действовавшим в Германии законам, он доложил о своём открытии в отдел хим орудия Управления вооружений сухопутных сил в Берлине и последующую работу с нервно-паралитическими ядами продолжал уже в закрытых лабораториях. В качестве токсина было использовано одно из самых опасных боевых нервно-паралитических веществ – агент VX.

Результаты показали, что разработанный учёными препарат БуХЭ более эффективен для профилактики отравлений ФОТ, чем БуХЭ плазмы крови. В текущее время сотрудники лаборатории готовят научные публикации по результатам своих исследований.

Иллюстрации предоставлены Денисом Илюшиным
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (10-04-00673-а), федеральной целевой программы 2046.2012.4 научной школы «Химические основы биокатализа», программы президиума РАН № 24 «Нанотехнологии и наноматериалы» и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, программа «У.М.Н.И.К.».

По данным Глобальной организации здравоохранения, бытовое смертельное отравление ФОТ получает более 300 тыщ человек в год. Действенное и неопасное противоядие к этим токсинам пробуют разрабатывать в почти всех лабораториях мира, одна из их – лаборатории биокатализа Института биоорганической химии РАН – близка к удачному решению задачки.

Ранее было понятно, как фосфорорганические токсины действуют на организм. «ФОТ связываются с ферментом ацетилхолинэстеразой и выводят из строя этот критически принципиальный элемент механизма передачи нервного сигнала, тем заблокируя сигнал на дыхательные мускулы, – объясняет научный сотрудник лаборатории биокатализа ИБХ РАН Денис Илюшин. – Потому сначала при отравлении происходит остановка дыхания».
Кроме того, исследователи химически изменили молекулы БуХЭ при помощи полисиалирования – новой и относительной дешёвой технологии, ранее успешно отработанной на инсулине.

Период полувыведения модифицированного таким макаром фермента составил уже 16 часов, столько же удерживается в крови БуХЭ из плазмы крови человека.
Чтобы проверить, как действует полученный фермент, учёные провели испытания, в процессе которых мышам внутривенно вводили или полисиалированную БуХЭ, или БуХЭ из плазмы крови человека.

Спустя полчаса мышей подвергали действию высоких доз ФОТ. Чем больше белок, тем хуже он будет фильтроваться в почках и тем дольше оставаться в организме. Чтобы увеличить размер молекулы рекомбинантного фермента, учёные совместили два подхода.

Они модифицировали культуру клеток так, чтобы вместе с БуХЭ она производила пептид, «склеивающий» мономеры фермента в тетрамеры. Время полувыведения рекомбинантной БуХЭ из крови при всем этом увеличилось до трёх часов.
Справка:

Получить отравление не так сложно: ФОТ, съеденные вместе с овощами и фруктами, которые были обработаны пестицидами, могут накапливаться в организме, откладываясь в жировой клетчатке. При резком сжигании жира в результате стресса, диет или активных упражнений токсины могут высвободиться в количестве, достаточном для отравления.

Чтобы этого не произошло, овощи нужно ошпаривать, или мыть в слабом мыльном растворе, или хотя бы очищать от кожуры
Последние исследования привели к формулированию концепции антидотов последнего поколения – биологических антидотов (bioscavenger, от англ. scavenger – мусорщик, уборщик, чистильщик), не вызывающих осложнений.

Одно из таких веществ – бутирилхолинэстераза крови человека (БуХЭ), близкая по своим свойствам к самой ацетилхолинэстеразе.
Недавние исследования на специально выведенных мышах, геном которых не содержит гена, ответственного за синтез БуХЭ, показали, что при отравлении фосфорорганическими токсинами такие грызуны гораздо более уязвимы, чем их собратья, организм которых вырабатывает БуХЭ.

«Этот факт свидетельствует о том, что БуХЭ является естественным антидотом, который из-за своего сходства с ацетилхолинэстеразой “вызывает огонь на себя” при отравлении ФОТ», – заключает Денис Илюшин. – Однако при отравлении пестицидами или боевыми ядами обычного количества БуХЭ в организме оказывается недостаточно».
Где взять натуральный антидот

Самый простой способ получить БуХЭ – выделить её из плазмы крови человека. На сегодня разработан протокол промышленной очистки фермента из просроченной плазмы, которую уже нельзя использовать для переливания.

По расчетам учёных, для эффективного связывания пяти отравляющих доз зарина в течение минуты – именно за такое время сердце успевает прокачать весь объём крови в человеческом организме – нужно примерно 200 мг БуХЭ. Для получения этой дозы требуется переработать от 200 до 500 литров плазмы.Попытки получить рекомбинантную БуХЭ в клетках бактерий и дрожжей не дали результата.

Выделять фермент из молока трансгенных коз оказалось нерентабельно. БуХЭ из клеток растения табака не одобрило Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США, что, на самом деле, закрыло дорогу этому способу во всём мире.

Большие надежды учёные возлагают на получение рекомбинантных белков в культуре животных, а именно в раковых клетках яичников китайского хомячка (линия CHO). Поэтому сегодня внимание учёных направлено на поиск других источников бутирилхолинэстеразы.

Современные методы биотехнологии, молекулярной биологии и генной инженерии позволяют получать практически любой белок человека, используя другие организмы. Для этого ген требуемого белка переносят в геном другой клетки.

Полученные таким способом белки называют рекомбинантными.
Таким макаром, для наработки небольшого запаса препарата в тысячу доз потребовалось бы переработать весь годовой запас крови США.

А если б препарат вышел на рынок, цена одной дозы составила бы около 15 тысяч долларов. Кроме того, всегда существует вероятность, что при очистке из плазмы в препарате останется возбудитель какого-нибудь заболевания, например вирус ВИЧ.

Эти клетки уже использовались для получения БуХЭ, но их продуктивность оказалась низка: всего 2–5 мг на литр ростовой среды, в то время как для рентабельного производства необходим выход более 30–50 мг. Сотрудники лаборатории биокатализа ИБХ решили улучшить этот метод.

Как получают бутирилхолинэстеразу в ИБХ
Исследователям удалось получить и клонировать клетку линии СНО с достаточно высоким выходом искомого фермента, также добиться уровня экспрессии активного белка до 40 мг на литр ростовой среды.

Успех омрачал тот факт, что полученный клон производил БуХЭ в главном в форме одиночного мономера, в то время как молекула «естественной» БуХЭ в нашей крови состоит из связанных между собой четырёх мономеров.
Время полувыведения полученного препарата из кровотока при внутривенной инъекции составило бы менее получаса. «Поскольку нашей целью сначала является профилактика отравлений ФОТ, препарат с таким временем полувыведения нас явно не устраивал», – поясняет Денис.

Скорость выведения фермента из крови почти во всем находится в зависимости от молекулярного веса белковой молекулы. С течением времени действие атропина прекращается, и нейроны восстанавливают свою работу.

Главная проблема такой терапии в том, что она чревата нежелательными последствиями: от головокружения и усталости прямо до летального исхода при острых отравлениях ФОТ. Получается, что атропин по сравнению с ФОТ – это лишь меньшее из двух зол, которое к тому же возможно окажется несвоевременным.

Противоядие для этих токсинов издавна сотворено – атропин. Он тоже ядовит и тоже «отключает» ацетилхолинэстеразу, но в отличие от ФОТ его действие обратимо. Попав в кровь, молекулы атропина начинают соперничать с молекулами ФОТ за связывание с ацетилхолинэстеразой.

Это даёт медикам время на выведение молекул ФОТ и их нейтрализацию. С того времени на базе фосфорорганических токсинов (ФОТ) учёные различных государств разрабатывали всё более действенные ядовитые вещества для военного и сельскохозяйственного внедрения и параллельно находили к ним антидоты.

Денис_Илюшин
Денис Илюшин: «Мне хотелось бы в качестве финишной точки проекта узреть мед продукт, участвовать в его промышленном производстве. Я надеюсь, что результаты этой работы не понадобятся; ведь в неприятном случае это значит, что кто-то отравился»

В 1997 году вступила в силу Конвенция о воспрещении хим орудия, но делему отравлений это не решило: фосфорорганические токсины продолжают употребляться в качестве инсектицидов.Медицина 2.0 (www.med2.ru)

Читайте также: